南宫28NG相信品牌力量，细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，旨在长期维持细胞的活性和功能。此技术对于细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立及细胞治疗的储备等方面都至关重要。通过冻存，可以显著减少细胞传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞处于最佳生长状态时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中不可或缺的成分，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，从而减少冰晶的形成，以保护细胞免受机械损伤。虽然DMSO广泛适用于多种细胞类型，但对于某些细胞来说可能过于敏感，此时可以选择使用甘油作为替代。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数及细胞类型等相关信息（如有基因改造等内容，也要注明）。
2. 若为贴壁细胞，移去细胞培养基，用PBS清洗后，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，放入37°C培养箱孵育约2分钟（孵育时间根据细胞类型略有不同）。
添加等量的培养基终止消化反应，再用移液枪轻轻操作将贴壁细胞轻松移入50mL的Falcon管中。
3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积细胞转移至50mL Falcon管中。
4. 使用血细胞计数器计数细胞，确认细胞活力至少达到75%。
5. 在室温下以300×g离心5分钟。
6. 准备冻存培养基（见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型：
- 在含有FBS培养基中培养的细胞：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
- 在无血清培养基中培养的细胞：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
- 需要甘油冷冻的细胞：90%胎牛血清 + 10%甘油
使用前充分混合并加热至37°C。冷冻培养基应含有必要的冷冻保护剂如DMSO，以防止细胞膜和内部成分受到冰晶的危害。

7. 移除上清液。
8. 加入冻存培养基至所需细胞密度，通常哺乳动物细胞的浓度为1×10^6/mL冻存液。细胞在冻存液中的室温放置时间不应超过10分钟。
9. 将1mL样品分装至冷冻管中，盖紧盖子。
10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后放入-80°C冰箱，确保冷冻过程中外周适量加入异丙醇，以每分钟1°C的速度缓慢降温。慢速冷冻有助于减少冰晶的形成。
11. 大约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管，移至液氮中进行长期储存，通常细胞可以在液氮中保存数年。尽量在一周内将冷冻细胞从-80°C转移至液氮中，以免长期的低温存储影响细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C的水浴中，直至解冻约80%（不要在室温下解冻）。该过程应控制在1分钟内完成。快速解冻有助于减少对细胞的损伤，同时迅速稀释DMSO以减轻其细胞毒性。
2. 使用移液器将管内内容物转移至约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。
3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，并用适量培养基重悬细胞沉淀。
4. 将细胞悬液转移至培养容器中，并放入37°C培养箱中进行培养。